大鯢活性肽對 D-半乳糖致小鼠機體氧化損傷的修復作用

大鯢（Andrias davidianus），屬于兩棲綱、有尾目、隱鰓鯢科，是我國特有的珍稀兩棲動物，屬于國家二類保護動物。大鯢不僅有豐富的營養，而且還有重要的藥用價值。據《本草綱目》記載：“鯢魚，甘，有毒。食之無癡疾。”1978 年出版的《全國中草藥匯編》將大鯢列為藥品，主要治療神經衰弱、病后體虛、貧血、痢疾等疾病。研究表明，大鯢含有豐富的蛋白質、不飽和脂肪酸、多糖、礦物質元素等成分。這些營養物質構成了大鯢活性成分的物質基礎。大鯢肌肉中蛋白質含量高，氨基酸比例合理，種類豐富。大鯢肌肉蛋白質經過酶解過程可以獲得具有抗氧化、免疫調節等生物活性的大鯢活性肽，適用于大鯢肽相關產品的開發。衰老是多細胞生物體在發育成熟后受多因素作用的生理機能退行性過程，主要有自由基、免疫、端粒-細胞與神經內分泌等學說解釋機體的衰老原因，但主流的解釋為自由基攻擊等氧化反應導致機體衰老。因小鼠體內臟器受氧化物攻擊，產生有毒有害物質無法及時清除，產生一系列生理生化應激反應，進而導致表觀上、生理上的退行性衰老。研究表明，長期大量對動物注射 D-半乳糖溶液，過多的 D-半乳糖在醛糖還原酶的作用下生成半乳糖醇，半乳糖醇不能被機體代謝，堆積在細胞內的半乳糖醇可以導致細胞的氧化應激反應，進而導致細胞內活性氧（reactive oxygen species, ROS）增加。過多的 ROS 引起細胞損害，導致機體多器官、多系統功能減退。D-半乳糖可以使機體的很多組織出現類似衰老的退行性改變，出現與衰老相關的毛色變暗、行動緩等體征、生化改變、免疫功能下降、退行性神經功能紊亂，還出現胰腺損傷、腦損傷以及腎臟損傷。因此，D-半乳糖致小鼠衰老模型被廣泛用來評價各種生物活性成分的抗衰老作用。

目前，對大鯢肌肉的營養成分進行分析的研究報道較多。對大鯢肽的酶解制備工藝及其具有抗氧化活性的研究也已有報道。但鮮有對大鯢肽具有的抗衰老作用的深入研究。本實驗采用D-半乳糖皮下注射建立小鼠亞急性衰老模型以及非定量標記蛋白質組學技術研究大鯢肽的抗衰老作用，以期從分子水平上闡明大鯢活性肽抗衰老機理，為大鯢的高值化開發利用提供科學依據。

 

1.1 材料與儀器

雄性 SPF 小鼠 體重 18~22 g，購于大連醫科大學實驗動物中心，生產許可證 SCXK（遼）2013-0003；大鯢活性肽 分子量 1400~2000 Da，由遼寧省水產品加工及綜合利用重點實驗室制備；D-半乳糖 國藥集團化學試劑有限公司；總抗氧化能力（Total antioxidant capacity, T-AOC）、超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase, SOD）和丙二醛（Malondialdehyde, MDA）測定試劑盒 南京建成生物工程研究所。5430R 低溫高速離心機、真空離心濃縮儀 Eppendorf 公司；Q exactive 質譜儀 Thermo Scientific 公司；Triple TOF 6600 + 質譜儀 AB SCIEX 公司；Agilent 1290 Infinity LC 超高壓

液相色譜儀 Agilent 公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 D-半乳糖致小鼠衰老模型的建立、給藥和處理將 60 只 SPF 級昆明小鼠（雄性）分為 5 組，分別為正常組、衰老模型組，大鯢活性肽低、中、高劑量組，對應劑量分別為：100、200、400 mg/（kg•d）。除正常組每天注射等體積生理鹽

水外，其他各組每天都單次皮下組織注射 5% D-半乳糖 0.5 mL/d（生理鹽水配制）。每周記錄 1次小鼠體重。大鯢活性肽低、中、高劑量組每日按 0.1 mL 大鯢活性肽水溶液/20 g 小鼠體重分別灌胃一次，正常組和衰老模型組以生理鹽水代替大鯢活性肽水溶液進行灌胃，同時觀察小鼠毛色與行動。連續灌胃 6 周后，稱重，摘取眼球取血，立即離心（3000 r/min 10 min），取上層血清，-20 ℃冰箱凍存備用。

1.2.2 小鼠組織臟器指數測定

小鼠稱重后處死，快速取出腦、肝臟、胸腺和脾 4 種臟器，用濾紙吸干血水，電子天平上稱重。按照公式（1）計算肝臟指數、腦指數、胸腺指數和脾指數。臟器指數（mg/10 g）=臟器質量（mg）/小鼠體質量（10 g） （1）

1.2.3 生化指標測定

測定小鼠血清中總抗氧化（T-AOC）能力、超氧化物歧化酶（SOD）活性和丙二醛（MDA）含量的測定，按試劑盒說明書的操作步驟進行。

1.2.4 蛋白質組樣品制備

取 50 μL 大鯢活性肽中劑量組和 D-半乳糖致小鼠衰老模型組小鼠血清，均采用去血清高豐度親和色譜柱 Agilent Multiple Affinity Removal LC Column-Mouse 3（4.6×100 mm，1.66 mL），獲得小鼠血清中低豐度蛋白組分。各樣品血清低豐度蛋白組分經過超濾濃縮后加入等體積 SDT 裂解液，沸水浴裂解 15 min，于 14000×g 條件下離心 20 min。采用 BCA 法對上清液進行定量。大鯢活性肽中劑量組小鼠血清樣品標記為 ADB-T，D-半乳糖致小鼠衰老模型組小鼠血清樣品標記為

ADB-M。

1.2.5 SDS-PAGE 電泳

取裂解后的各樣品分別取 20 μg，分別加入等體積 2×上樣緩沖液，沸水浴 5 min，取 20 μL進行 12.5% SDS-PAGE 電泳后，考馬斯亮藍染色后脫色液脫色，判斷樣品裂解情況。

1.2.6 樣品酶解

采用 Filter aided proteome preparation (FASP)方法對各樣品進行酶解。分別取樣品 ADB-T及 ADB-M 各 30 μL 蛋白質溶液，分別加入 0.003 mmol DTT，沸水浴 5 min 后冷卻至室溫。加入200 μL 尿素緩沖液（8mol/L 尿素，150 mmol/L Tris-HCl，pH8.0）混勻后，在 10 kD 超濾離心管中于 14000×g 離心 15 min，棄濾液（重復該步驟一次）。加入 100 μL 100 mmol/L IAA 緩沖液（以尿素緩沖液溶解），在 600 r/min 條件下振蕩 1 min，室溫避光 30 min 后于相同離心條件下進行離心。加入 100 μL 尿素緩沖液，相同離心條件下離心，該步驟重復兩次。加入 100 μL 25 mmol/L NH4HCO3 溶液，相同離心條件下離心兩次。加入 40 μL 0.1 g/L 胰蛋白酶緩沖液（以 100 mmol/L NH4HCO3 溶液配制），600 r/min 振蕩反應 1 min，37℃靜置 16 h。換新收集管，相同離心條件下離心；再加入 40 μL 25 mmol/L NH4HCO3，在相同離心條件下離心并收集濾液。通過 C18 Cartridge脫鹽凍干后以 40 μL 0.1%甲酸溶液復溶，測定 280 nm 吸光值。

1.2.7 LC-MS/MS 分析

根據 FASP 酶解后 OD280 定量結果，各取 2 μg 酶解后的 ADB-T 及 ADB-M 進行 LC-MS/MS分析。樣品先經過 RP-C18毛細管高效液相色譜柱（Thermo EASY column SC200 150 μm×100 mm）的納升流速 HPLC 液相系統 EASY-nLC1000，以甲酸乙腈水溶液進行梯度分離。預柱為 RP-C18 Thermo EASY column SC001 traps 150 μm×20 mm。A 液為 0.1%甲酸乙腈水溶液（乙腈為 2%），B 液為 0.1%甲酸乙腈水溶液（乙腈為 84%）。梯度條件為：0～100 min，B 液線性梯度 0%～45%；100～108 min，B 液線性梯度 45%～100%；108～120 min，B 液維持在 100%。分離后用 Q-Exactive質譜儀進行質譜分析。預分析時長 60 min, 正式分析時長 120 min。

1.2.8 MaxQuant 的數據分析

質譜分析原始數據為 RAW 文件，采用 MaxQuant 軟件（版本號 1.3.0.5）進行查庫鑒定，并根據 Label free 算法進行定量分析。

1.2.9 Gene Ontology (GO)功能注釋

利 用 Blast2GO 對目標蛋白質集合進行 GO 注釋。利用 NCBI BLAST+(ncbi-blast-2.2.28+-win32.exe)比對小鼠血清數據庫，保留 E 值小于等于 0.001 的前 10 條。再依次通過提取、注釋。

1.2.10 KEGG 通路注釋

KEGG Automatic Annotation Server 軟件獲取目標蛋白質序列參與的通路信息。通過 Fisher精確檢驗評價 GO term 或 KEGG 通路蛋白質富集度的顯著性水平。

1.2.11 蛋白質聚類分析(Clustering)對目標蛋白質定量信息歸一化處理后，進行蛋白質聚類分析。

1.3 數據處理

數據處理采用 SPSS 19.0 軟件進行單因素方差分析，結果表示為平均值±標準差，P<0.05 為差異顯著。

 

2.1 小鼠體質變化情況及臟器指數

各組小鼠在實驗前，皮毛有光滑，喜攀爬、嚙咬樹枝。衰老模型組小鼠連續 6 周每天皮下組織注射 5% D-半乳糖 0.5 mL 后，小鼠毛色變暗，行動遲緩，攀爬行為減少等變化。該結果與黃杰等建立D-半乳糖致衰老小鼠的反應與狀態變化結果相似。衰老模型組小鼠體重僅增加56.18%，正常小鼠體重增 60.30%，增加量低于正常組（圖 1）。灌胃低、中、高濃度大鯢活性肽水溶液各組小鼠平均體重高于模型組，趨近于正常組，但未表現出劑量依賴性，表明大鯢活性肽在低劑量情況下既具有促進衰老小鼠恢復生長作用。各組 SPF 級雄性昆明小鼠灌胃對應大鯢活性肽溶液 6 周后，小鼠臟器指數變化如表 1。由表 1可以看出，各灌胃大鯢活性肽組的腦指數、胸腺指數與正常組相比不顯著（P>0.05）；中劑量組的脾指數顯著高于正常組（P<0.05）；低、高劑量大鯢活性肽組的肝指數均極顯著低于模型組（P<0.01）。灌胃大鯢肽后，小鼠的脾臟指數增加，表明大鯢肽在一定程度上可以增強小鼠機體免疫功能。

 

圖 1 大鯢活性肽對小鼠體質量的影響

Fig.1 Effect of giant salamander bioactive peptides on body weight of

注：同組不同小寫字母，表示為同組不同時間差異顯著（P<0.05）；同組相同小寫字母，表示為同組不同時間差異不顯著（P>0.05）

 

表 1 大鯢活性肽對小鼠臟器指數的影響

Table 1 Effect of giant salamander bioactive peptidesonorgan indexes for each group of mice