摘 要: 近年來, 隨著大鯢養殖業的發展, 對大鯢進行深加工成為大鯢產業發展的關鍵。大鯢體表黏液是一種有重要應用價值的生物資源。大鯢體表黏液主要含有蛋白質及多糖類物質。利用海洋微生物酸性蛋白酶(Aspergillus sp. acid protease)以及膜分離、納濾膜除鹽等步驟, 從大鯢體表黏液中制備出了分子量小于 3500 Da的大鯢低聚糖肽。β-消旋反應、血凝集抑制試驗結果表明大鯢低聚糖肽具有 O-連接糖肽鍵。大鯢低聚糖肽具有促進小鼠免疫功能的作用、體外抗氧化活性、抗疲勞作用、抗紫外線能力以及對 CCl4 導致小鼠肝損傷具有保護作用。大鯢低聚糖肽在食品、保健食品以及藥品領域有著廣泛的潛在應用。本文對大鯢低聚糖肽這一新的生物活性物質的制備、特性及生物活性研究進行全面的論述總結, 以期為正確鑒定、研究及利用大鯢低聚糖肽提供方法與數據。
關鍵詞: 大鯢低聚糖肽; 黏液; 鑒定; 應用

基金項目: 湖南省戰略性新興產業科技攻關與重大科技成果轉化項目(2013GK4100)
 

1 引 言

大鯢

(Andrias davidianus)是我國二級保護動物。自20 世紀 80 年代開始, 為了保護這一珍稀物種, 人們開始了大鯢繁育養殖實驗, 先后解決了培育大鯢親本的方法以及大鯢親本雌雄發育同步的技術難題, 成功進行了野生大鯢馴養繁殖等方面的研究, 形成了一批大鯢養殖企業。隨著大鯢養殖規模的擴大, 大鯢產量的迅速增加, 國家相關主管部門逐步放寬了子二代大鯢作為產品進入市場的禁令,獲得經營大鯢產品資質的企業越來越多。大鯢養殖業已逐漸成為調整農業結構、促進農民增收的新興養殖產業。但是目前大鯢的養殖產量并沒有和養殖效益成正比, 這其中主要原因是大鯢深加工的科研成果不多, 沒有形成高值化利用的技術與產品。
大鯢作為我國珍貴的國家二級保護動物, 除了具備的生物學和生態學的價值外, 大鯢體內獨特的營養成分等化學物質組成也使其具有較高的經濟和藥用價值。研究表明, 大鯢的肌肉、皮膚、內臟、脂肪、血液等含有豐富的蛋白質、氨基酸、脂肪酸及微量元素等。大鯢體表黏液也是大鯢中具有重要開發利用價值的一種資源。自2008 年 7 月起, 張家界(中國)金馳大鯢生物科技有限公司就根據企業自身發展需要, 開始了與大連海洋大學合作開始進行了大鯢體表黏液的研究。經過近兩年多的研究, 率先利用海洋微生物酸性蛋白酶(Aspergillus sp. acid protease)以及酶膜反應技術, 從大鯢體表黏液中制備出分子量小于3500 Da 的大鯢低聚活性糖肽。2010 年 3 月申報了“大鯢低聚糖肽、制備方法及其在化妝品中的應用”的發明專利,于 2013 年 9 月獲得了專利授權。隨后, 大連海洋大學對大鯢低聚糖肽的制備工藝、結構、活性及其應用進行了深入研究, 獲得了許多關于大鯢低聚活性糖肽的研究結果。這些研究結果為大鯢低聚活性糖肽在食品、保健食品、新資源食品、特殊醫學用食品以及藥品等領域的應用提供了重要的基礎數據。令人感興趣的是隨后出現的其他一些研究者對大鯢低聚活性糖肽進行了研究, 如陳麗萍等研究了大鯢低聚糖肽抑菌、抗血小板聚集活性。王茁研究了不同育齡大鯢皮膚黏液中低聚糖肽抗氧化活性。還有一些大鯢產業相關的公司準備進行大鯢低聚糖肽相關產品的研發。

2 大鯢低聚糖肽的研究

2.1 大鯢低聚糖肽的制備
大鯢體表黏液是制備大鯢低聚糖肽的原料。大鯢皮膚表面具有豐富的黏液腺和顆粒腺, 顆粒腺分泌大量乳白色液體, 黏液腺分泌的水樣透明液, 并且皮膚腺收縮時可排出腺腔中的黏蛋白類及多糖類物質, 能保持皮膚濕潤。在大鯢的生長過程中, 它會不斷分泌大鯢黏液, 一條成年大鯢每年分泌的大鯢黏液可達 500 g。劉紹等和 Li 等對大鯢體表黏液的氨基酸組成進行了測定分析, 發現其氨基酸組成全面, 可以作為優質食物蛋白的來源。陳德經等從大鯢體表黏液中提取了多糖, 最高提取率為 4.23%, 并發現不同的提取方法獲得的多糖的單糖組成存在差異。金橋等整理了大鯢黏液氨基酸組成的摩爾比, 發現摩爾百分比的最高的氨基酸是蘇氨酸、天冬氨酸/天冬酰胺、谷氨酸/谷氨酰胺。Guo 等接著從大鯢黏液中分離出磷酸脂酶 A2, 同時還發現大鯢黏液具有損傷活性和蛋白酶活性,經 SDS-PAGE 對大鯢黏液蛋白進行檢測, 發現其分子量分布較寬。王利鋒等利用 5%乙酸浸提、SephadexG-50 及 Sephadex G-25 凝膠過濾層析, 從電刺激法獲得的大鯢黏液中獲得了一種分子量為 4300 Da 的具有抗菌活性的肽, 該肽對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、銅綠假單胞菌、溶血性鏈球菌和白色念珠菌均有較強的抑菌作用, 對這些菌的最小抑菌濃度分別為 12、16、16、22、16 及 18 μg/mL。因此, 大鯢黏液是一種有價值的糖蛋白的來源。酶解技術是利用蛋白質、多糖類資源的一種有效的技術。酶解技術的優點是可以將水不溶的蛋白質、多糖類化合物酶解成具有可溶性小分子的肽、寡糖類化合物, 使其具有更好的生物活性。大鯢分泌出的體表黏液, 在空氣及水環境中, 很快凝固形成透明片狀物。實驗表明, 大鯢黏液在乙醇濃度較低時, 溶解度較小, 在乙醇濃度達到 70%時, 濃度略有上升, 在 EDTA、EDTA/甲醇中, 大鯢黏液溶解度略有增加。因此, 選擇合適的酶進行酶解成為利用大鯢黏液的關鍵。經過反復實驗, 利用海洋微生物酸性蛋白酶(Aspergillus sp. acid protease)以及膜分離、超濾膜除鹽等步驟, 從大鯢體表黏液中制備出了分子量小于 3500 Da的大鯢低聚活性糖肽。

2.2 大鯢低聚糖肽結構
大鯢低聚糖肽的紅外光譜表明, 其具有 3275.2、1653.3 和 1454.9 cm-1的酰胺官能團、3063.8 cm-1的咪唑官能團以及 2962.3、1402.3 cm-1的羥基特征峰。β-消旋反應是鑒定糖肽的一種常用的方法, 與 O-糖肽鍵連接的絲氨酸生成 α-氨基丙烯酸, 蘇氨酸生成 α-氨基丁烯酸, 這種不飽和氨基酸的形成, 使糖肽在 240 nm 波長處紫外吸收增強。β-消旋反應前后大鯢低聚糖肽在 240 nm 處的紫外吸收顯著增強, 說明大鯢低聚糖肽中存在 O-連接糖肽鍵。海綿凝集素(craniella australiensis lectin, CAL)可以專一識別-Galβ1-3 GalNAc α-O-Ser /Thr 結構。利用 CAL 的血凝活性測試證實了大鯢低聚糖肽中存在 O-連接糖肽鍵。Kong 等利用高效液相色譜(high performance liquidchromatography, HPLC)(NH2, 150 mm×4.6 mm ID)從大鯢糖肽中分離出 15 個含有糖鏈的化合物, 質譜檢測其分子量小于 3500 Da。

2.3 大鯢低聚糖肽的生物活性
對于大鯢低聚糖肽的生物活性也進行了大量的研究。曲敏等研究了大鯢低聚糖肽對小鼠免疫功能的影響, 飼喂大鯢低聚糖肽的小鼠血清中的 IgG 含量、吞噬雞紅細胞的巨噬細胞數以及 T 淋巴細胞活性均顯著提高。曲敏研究了大鯢低聚糖肽體外抗氧化活性, 大鯢低聚活性糖肽具有較好的清除自由基的活性。大鯢低聚糖肽對血管緊張素轉換酶(angiotesin-converting enzyme, ACE)具有較好的抑制活性, 因此可以作為潛在的抗高血壓藥物進行深入研究。大鯢低聚糖肽抗疲勞作用研究表明, 大鯢低聚糖肽具有顯著抗疲勞作用。大鯢低聚糖肽具有較強的抗紫外線能力, 因此被用來開發成化妝品。大鯢低聚糖肽還對CCl4 導致的小鼠肝損傷具有保護作用。研究表明, 大鯢低聚糖肽與 Caco-2 細胞、HaCaT 細胞相互作用后, 大鯢低聚糖肽可以進入到細胞內部。HaCaT 細胞模型具有人正常的皮膚上皮結構, 一般用來模擬人的皮膚細胞, 廣泛應用于研究化妝品對于皮膚受損的修復以及紫外線保護作用等方面的研究。

2.4 大鯢低聚糖肽鑒定
糖肽(glycopeptide)即由短糖鏈和短肽連接而成所得到的化合物。近年來, 在動物、植物及微生物中都有大量的糖肽被發現。比如從植物中獲得的有魔芋甘露聚糖肽、板藍根糖肽以及云芝糖肽等。從動物中獲取的糖肽有文蛤糖肽、馬鹿茸降血糖肽、大鯢低聚糖肽以及海蜇糖肽等。微生物和病毒表面往往具有糖肽結構。進行糖肽的鑒定, 首先需要進行糖肽的富集。糖肽富集的方法有化學方法、超支化聚合物富集方法、二氧化鈦結合超濾膜富集方法、氧化鋁富集方法等。在確定其是否來自大鯢, 最準確的辦法就是使用PCR 技術。除此之外, HPLC、紅外光譜、β-消旋反應、質譜等等也是可以選擇的手段。如江靜等利用親水相互作用色譜結合串聯質譜對完整的糖肽進行了分離純化以及鑒定。β-消旋反應可以鑒定糖肽鍵連接類型。β-消旋反應前后, 具有 N-連接糖肽鍵的糖肽在 240 nm 波長處紫外吸收不發生變化, 而 O-連接糖肽鍵在 240 nm 處的紫外吸收顯著增強。對大鯢低聚糖肽進行納升電噴霧-四極桿-飛行時間串聯質譜分析, 串聯質譜圖經 Micromass 專用軟件處理后, 用 Spectrum List 通過 Mascot 查詢 NCBI、SWISSPROT 等數據庫, 經 MasSeq 軟件分析, 得到 3 個序列為: KAPILSDSSCKSC、KLQGTVSWGSGCQAKNC 和VVHSLVQVTANKVMVRM。這 3 個肽序列與肽數據庫(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)中肽無同源性。

化學方法測定大鯢低聚糖肽中總蛋白含量較高為80.01%, 總糖含量為 15.15%?？偺侵宣}酸氨基葡萄糖最高, 半乳糖醛酸其次, 之后依次為葡萄糖醛酸和唾液酸,分別占大鯢低聚糖肽 3.39%、2.45%、0.65%、0.60%, 占總糖含量的 22.38%、16.17%、4.29%和 3.69%, 不含硫酸糖。從不同產地、不同季節、不同生長階段獲得的大鯢低聚糖肽其糖的組成不同, 但是組成多糖的單糖單元比較多。

血凝活性測試方法是比較簡單快捷的方法。這種方法需要利用海綿凝集素 CAL 的糖識別特性。CAL 是一種專一識別 O-連接糖肽鍵的凝集素。對大鯢低聚糖肽的O-連接糖肽鍵特異性識別, 大鯢低聚糖肽的分子結構與CAL 的糖結合位點正好相符。

3 結論與展望
大鯢自古以來就是傳統的藥用動物, 在《本草綱目》、《草本綱目拾遺》等經典醫著中均有描述。中醫認為大鯢性甘平, 有補氣、養血、益智、滋補、強壯等功效。主治神經衰弱, 病后體虛, 貧血, 痢疾等。1978 年出版的《全國中草藥匯編》將大鯢列為藥品, 主治神經衰弱、病后體虛、貧血、痢疾等。大鯢的皮膚、肌肉、臟器、骨骼等均可入藥, 可見其在中藥學中的地位。在傳統醫學中, 大鯢一般去除內臟后全體入藥, 每次用量為 15~30g。民間有以大鯢皮膚粉拌桐油治療燙傷、以其膽汁用以解熱明目、以胃治療小孩消化不良、以皮膚黏液預防麻風病的方法, 療效明確。大鯢作為中藥, 其確切的療效已經為人們所公認。但中藥的療效往往有很多未解之謎,需要運用化學、生物等手段進行分析, 以便解開中藥藥理作用的秘密。大鯢作為中藥, 同樣存在著許多的未解之謎。

大鯢低聚糖肽作為一種新的具有生物活性的物質,一經出現就引起了人們的極大關注。通過對大鯢低聚糖肽結構及生物活性的深入研究, 有助于促進大鯢藥理作用的深入研究, 也有助于大鯢的高值化在食品、保健食品以及藥品領域的應用。