大鯢低聚糖肽對小鼠免疫功能調節作用的研究

免疫活性物質包括多糖、寡糖、多肽、核酸、留醇類、黃酮類等多種不同組成、不同分子量的物質，其來源廣泛，包括動物、植物和微生物。免疫活性物質在醫藥、食品、飼料等領域有廣泛的用途。不斷發現和開辟免疫活性物質的來源是現代生物技術的一個研究熱點。

大鯢是中國特有的二級保護動物。近年來，通過人工馴養繁殖，大鯢資源在湖南、浙江、陜西、河南、湖北已得到快速增長。大力發展大鯢深加工途徑已經成為目前的一個重要任務。金橋等發現從大鯢皮膚黏液中制備的大鯢低聚糖肽具有清除羥自由基的作用，現明顯的量效關系。李偉等發現大鯢低聚糖肽>i冇較強的抗疲勞作用。至于人鯢低聚糖肽對機體免疫機能的調節作用研究來見報道。筆者對大鯢低聚糖肽對小鼠免疫功能調節的影響進行了研究，進而為大鯢黏液的開發利用和將其開發成新的保健品提供實臉數據。

1 材料與方法

1.1試驗材料

大鯢低聚糖肽，按李偉等方法，由遼寧省水產品加工及綜介利用玉點實驗室制備。
清潔級昆明種小鼠，體質W18-22g,雌雄各半，購自大連醫科大學實驗動物研究中心[SCXK(II)2008-0002],T12h黑Bg，12h光克的塑料飼養筘內養，室溫（20±2)相對濕度，自由采食和飲水。豚鼠，體質量300~400g，構自大連眹科大學實驗動物研究中心[SCXK(遼)2008-0002]。

1.2血清中lg測定

32只小鼠隨機分為4組：對照組以及低、中、高3個劑量組。大鯢低聚糖肽溶于生理鹽水中，毎天定時等體積灌胃1次，灌胃的大鯢低聚糖肽分別為0、0.01、0.05、0.1g(kg.bw),連續灌胃8d。最后一次灌服大鯢低聚搪肽后1h.摘眼球取血.將采集的全血于37°C恒溫30min，然后于4°C冰箱屮1h，在3000r/inin下離心3min，分離血清，將抗小鼠IgG單抗溶液包被丁酶標板上，毎孔中加入100mL待測血濟，37°C孵育2h。PBS洗板3次后，毎孔屮加入生物索標記的抗小鼠IgG單抗100μL.37°C孵育1h。PBS洗扳3次后，加人辣根過氧化物酶標記的鏈霉親和素（Streptavidin）與生物素結合，加人酶底物（0.4mg/mL鄰苯二胺和0.1mol/L的檸檬酸-磷酸緩沖液中的0.01%H?O?，pH5.0)。反應10min后，每孔加入50μL0,2mol/L的H?SO4終止反應。在492mm處測定吸光值。通過標準曲線求出對應的IgG值。

1.3吞噬功能測定

小鼠分組及給藥方法如1.2。最后1次灌服大鯢低聚搪肽1h,腹腔注人20%(v/v，牛理鹽水配制）雞紅細胞懸液1ml。30min后，腹腔注射生理鹽水，取腹腔液涂片，瑞氏染色，計數200個巨噬細胞.計數吞噬雞紅細胞的巨噬細胞數。

1.4T淋巴細胞數置的測定

小鼠分組及給藥方法如1.2。取小鼠新鮮血液0.5mL，置于載玻片上，吹干。在4°C的福爾4林-丙酮固定液中，固定1min。取出蒸餾水沖洗3min，吹干。用4%副品紅鹽酸溶液、4%亞硝酸鈉溶液以及2%α-醋酸萘酯乙二醇甲醚溶液組成的孵育液于37°C孵育1.5h。孵痛后蒸餾水沖洗3min.用2%的甲基綠復染1min，油鏡觀察。計數200個T淋巴細胞，以胞漿內含有1個或數個棕紅色顆粒者為，α-醋酸萘酯稱（ANAE)陽性淋巴細胞。

1.5統計學處理

用SPSS統計軟件對實驗數據進行處理，數值以（x±s)表示，P<0.05為差異顯著。

2 結果與討論

2.1對血清中IgG的影響

連續灌胃8d，與對照組相比，低、中、高劑量組小鼠血清中IgG數量差異顯著（P<0.05)，其中50mg/kg劑量組高出對照絎的2.5倍（圖1）。IgG起著激活補體，中和多種毒素的作用，同時它也是反應機體免疫狀態的重要指標。大鯢低聚搪肽可以顯著增加小鼠的IgG數量。因此，它具有對正常小鼠體液免疫功能的促進作用。

2.2吞噬功能

試驗結果顯示，連續灌胃8d后各劑量組吞噬雞紅細胞的巨噬細胞數顯著增多。計數200個巨噬細胞，其中50mg/kg劑量組吞噬雞紅細胞的巨噬細胞數達133個（圖2）。大鯢低聚糖肽具有提高小鼠巨噬細胞吞噬雞紅細胞的功能。

2.3T淋巴細胞數數量測定

ANAE是T淋巴細胞溶酶體中重要的非特異性同工酶，ANAE陽件率反應T淋巴細胞免疫水平。從圖3可以看出，連續灌胃8d后50mg/kg劑量組ANAE陽性率顯著高于對照組（P<0.05）即大鯢低聚糖肽能增強小鼠的細胞免疫功能。

大鯢體表黏液主要由蛋質和寡糖鏈組成。李偉等利用動物蛋白酶和海洋微生物蛋白酶從大鯢體表黏液中制備出大鯢低聚糖肽。黃酮、小肽、多糖類作為免疫激活劑已有很多的報道，糖肽類物質屬于肽類物質，與肽類不同的是它具N-乙酰半乳糖胺與絲氨酸或蘇氨酸縮合形成的O-糖苷鍵或者N-乙酰葡萄糖胺與天冬酰胺縮合形成的N-糖苷鍵。研究表明，大鯢低聚糖肽具有O糖苷鍵結構。具有O-糖苷鍵結構的大鯢低聚糖肽增強免疫的機理還有進一步研究。

3 結論

該研究證明了不同劑量的大鯢低聚糖肽在給飼小鼠8d后，對照組相比較，低、中、高各劑量提高了小鼠的抗體生成量、吞噬雞紅細胞的巨噬細胞數以及T淋巴細胞活性。提示大鯢低聚糖肽具有提高小鼠的免疫功能的作用。