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大鯢黏液酶解產物的制備及其抗疲勞作用研究
摘 要: 以大鯢黏液為原料，采用復合蛋白酶進行酶解，研究其最佳酶解條件以及酶解產物抗疲勞作用。結果表明，酶解 大鯢黏液的最佳工藝條件為復合酶加量為0.5% ( 質量比) 及底物濃度為0.1mg /mL 時，酶解時間2h，pH8.0，溫度65℃。時 間飛行質譜表明酶解產物為分子量小于 4000，苯酚硫酸法測定其為低聚糖肽。將低聚糖肽給小鼠灌胃 15d 后進行小鼠 負重游泳實驗，結果顯示大鯢低聚糖肽組使小鼠游泳力竭時間達到 103min( P < 0.01) ，肝糖原的消耗量比空白對照組減 少 65.0% ，肌肉中乳酸的量比空白對照組減少了 24.4% 。結果表明，大鯢低聚糖肽具有顯著抗疲勞作用。
關鍵詞: 大鯢黏液，復合蛋白酶，抗疲勞，小鼠
大鯢( Andrias davidianus) 屬兩棲綱、有尾目、隱鰓鯢科，是我國特有的珍稀特產，屬國家二類保護動物。主要分布于長江中上游、珠江中上游及漢水上游的溪流中。上世紀 90 年代以來，湖南、湖北、陜西及廣西都建立了大量的大鯢馴養繁殖企業。僅湖南省就有大鯢馴養繁殖企業 35 家左右，年繁殖能力已達 4～5 萬尾。隨著養殖規模的發展，大鯢資源的精深加工利用成為一個關系大鯢產業持續發展的緊迫課題。目前，對大鯢的深加工均是宰殺后提取皮、肉、骨來利用，這樣的利用方法對大鯢資源的保護與繁殖非常不利。另一方面，大鯢體表無鱗，多皮膚腺，在生長過程中不斷分泌黏液。如果能夠對大鯢體表黏液進行利用，就可以做到既利用大鯢資源，又不危害大鯢的生長繁殖，實現大鯢資源可持續利用的最理想狀態。本文以大鯢黏液為原料，采用復合酶進行酶解，制備出分子量小于 4000 的大鯢低聚糖肽。利用小鼠進行抗疲勞實驗，發現大鯢低聚糖肽具有抗疲勞作用，是保健食品潛在的原料。
1 材料與方法
1.1 實驗材料
大鯢黏液 2009 年 9 月由張家界( 中國) 金馳大鯢生物科技有限公司制備; 海洋堿性蛋白酶 由俄羅斯科學院遠東分院太平洋生物有機化學研究所提供; 胰蛋白酶( 1∶250) 購于北京索萊寶( Solarbio) 科技有限公司; 其他化學試劑 均為國產分析純試劑。
1.2 實驗方法
1.2.1 大鯢黏液酶解液的制備 取新鮮大鯢黏液，洗凈后用組織搗碎機研磨成糜，經硫酸銨沉淀法得大鯢黏液蛋白粗提液。將海洋堿性蛋白酶和胰蛋白酶按活力單位比為7∶3 比例混合作為酶解用復合酶，改變溫度、pH、加酶量和時間等因素，測定肽含量。
1.2.2 蛋白含量和酶解液肽含量的測定 蛋白含量采用 Folin－酚法測定。采用三氯乙酸( TCA) 沉淀大分子蛋白質后，采用 Folin－ 酚法測定酶解液的肽含量。
1.2.3 糖含量的測定 采用三氯乙酸( TCA) 沉淀大分子蛋白質后的酶解液用苯酚－硫酸法檢測樣品中糖含量。
1.2.4 酶解產物分子量分布的測定 凍干的酶解產物用 5～10μL 0.15% 三氟乙酸( TFA) 溶解。然后離心取上清液與等體積的基質混合點靶進行時間飛行質譜( MALDI－TOF) 測定。質譜儀為 Bruker Autoflex時間飛行質譜( Bremen，德國) 。質譜測定條件: N2 激光源，波長 337nm，正離子線性方式檢測( 飛行管長1.6m，加速電壓 25kV) ?；|: 芥子酸( SA) ，用 0.1%TFA/50% 乙腈配成飽和溶液，再將該溶液與 0.1%TFA/50% 乙腈以 1∶1 的比例混合。
1.2.5 小鼠負重游泳實驗 按謝偉斌等的方法。
選昆明種雄性小鼠 16 只，3～4 周齡，體重( 16 ± 2) g，隨機分成實驗組和對照組，每組 8 只。每天灌胃 1次，連續 15d，實驗組灌胃劑量為 1.6mg /kg 體重，每個劑量組每天灌胃劑量 0.1mL /16g 體重，對照組灌服相同體積生理鹽水。在末次灌胃 30min 后，給小鼠尾部負重 5% 的鉛絲，在恒溫水槽中進行游泳，水槽深度為 40cm 左右，水溫在( 30 ± 2) ℃。小鼠游泳力竭后取出測定生化指標，記錄從小鼠開始進入水中至頭部全部沒入水中 10s 不浮出水面的時間，即為游泳時間。
1.2.6 小鼠肝糖元的測定 取出小鼠肝臟，用生理鹽水沖洗干凈，用濾紙吸干后準確稱量 0.1g 肝臟，加入 2mL TCA 勻漿，將勻漿在 5000r/min 條件下離心20min，取1mL 上清液，再加入4mL 蒽酮試劑，沸水浴中煮沸 10min，取出后用水冷卻，于 620nm 測吸光度。在葡萄糖標準曲線上查出樣品液的糖含量。以 1mL蒸餾水為對照。
1.2.7 小鼠肌乳酸的測定 取出小鼠后腿肌肉 0.1g，用生理鹽水勻漿，將勻漿 5000r/min 離心 20min，取1mL 上清液，加入蒸餾水至 5mL，加入 20% 硫酸銅1mL，加入氫氧化鈣粉末約 0.5g，振搖 1min，靜置10min，以 3000r/min 離心 10min，取上清 0.5mL，加入濃硫酸 3mL，充分混勻后，置于沸水浴中 5min，然后放入冷水中 3min。加入 0.5% 對羥聯苯溶液 0.15mL，充分混勻后，置于沸水浴中 5min，然后放入冷水中冷卻后，于 510nm 測定吸光度。在乳酸標準曲線上查出樣品液的乳酸含量。
2 結果與討論
2.1 復合酶酶解大鯢黏液制備低聚糖肽單因素條件的影響
2.1.1 酶解溫度對復合酶酶解大鯢黏液制備低聚糖肽的影響 復合酶酶解大鯢黏液制備的低聚糖肽經苯酚－硫酸法檢測糖含量占 27.6% ( 質量比) 。將酶解條件設定為: pH7.5，復合酶量為 0.5% ( 質量比) ，于 35、45、55、65、75℃ 下分別酶解 2h，底物濃度為0.1mg /mL。測定肽含量得結果如圖 1 所示。由圖 1可知，當酶解溫度在 35～65℃ 之間變化時，隨著酶解溫度繼續上升，所得到的肽量逐漸升高，但當溫度達到 65℃，肽含量達最大值后，再繼續提高酶解溫度，所得到的肽含量則出現下降的趨勢。溫度過高，可以使酶變性甚至失活。所以，最適大鯢黏液酶解反應的溫度為 65℃。
2.1.2 pH 對復合酶酶解大鯢黏液制備低聚糖肽的影響 將酶解條件設定為: 復合酶量為 0.5% ( 質量比) ，pH 分別為 5、6、7、8、9，于 65℃ 酶解 2h，底物濃度為 0.1mg /mL。測定所得肽量得結果如圖 2。由圖2可知，隨著 pH 的逐漸升高，肽含量也隨著上升，當 pH上升到8.0 時肽含量最大，之后再升高 pH，所得到的肽含量出現下降趨勢。原因是復合酶中的海洋堿性蛋白酶與胰蛋白酶本身的最適 pH 在 8.0 左右，pH 過高或過低時會影響海洋堿性蛋白酶與胰蛋白酶的活性。所以，最適大鯢黏液酶解反應的 pH 為 8.0。
2.1.3 酶解時間對復合酶酶解大鯢黏液制備低聚糖肽的影響 將酶解條件設定為: 復合酶量為 0.5%( 質量比) ，pH 為 8.0，底物濃度為 0.1mg /mL，于 65℃酶解時間分別為 1、1.5、2、2.5h，測定所得肽含量結果如圖 3 所示。所得肽含量隨著酶解時間的增加而增加，酶解時間 2h 以后所得肽量上升幅度平緩。綜合生產成本因素，確定酶解時間為 2h 為最佳。
2.1.4 復合酶加量對復合酶酶解大鯢黏液制備低聚的影響 將酶解條件設定為: pH 為 8.0，底物濃度為 0.1mg /mL，于 65℃ 酶解 2h，復合酶加量分別為0.3% 、0.4% 、0.5% 、0.6% 、0.7% ( 質量比) ，測定所得肽量結果如圖 4 所示。由圖 4 可知，隨著酶加量的增加，所得肽含量逐漸升高，復合酶加量大于0.5% 時肽得率上升幅度平緩。綜合生產成本和所得肽含量兩方面考慮，確定復合酶加量大于 0.5%( 質量比) 。
2.1.5 復合酶最佳酶解條件的確定 影響酶解反應的幾個主要因素為復合酶加量、酶解時間、pH 和溫度。根據上述單因素實驗分析，并考慮生產成本的因素，以所得肽含量為指標做復合酶加量為 0.5%( 質量比) 時，酶解時間、pH 和溫度 3 因素 3 水平的正交實驗 L9 ( 33) ，正交實驗的因素水平見表 1，正交實驗結果見表 2。
由表 2 可知，各因素對復合酶酶解大鯢黏液制備低聚糖肽的影響的大小順序為 C > A > B，即 pH >酶解時間 > 溫度，最優水平為 A3B3C2，即 pH 為 8.0，酶解時間 2h，溫度 65℃。因此，確定復合酶最佳酶解條件為復合酶加量為 0.5% ( 質量比) 時，時間 2h，pH8.0，溫度 65℃，底物濃度為 0.1mg /mL。
2.2 大鯢低聚糖肽時間飛行質譜
圖 5 的時間飛行質譜表明復合酶酶解大鯢黏液獲得的大鯢低聚糖肽的 m/z 在小于 4000 的區域。m/z主要有 1172.3、1378.4、1436.3、1551.2、1694.9、1866.3、1981.0、2081.3、2200.7、2534.2、2929.2、3133.0、3326.0、3553.5、3907.2。根據含糖量及氨基酸殘基分子量可知，獲得的糖肽含有氨基酸殘基數大約為7～24 個。
2.3 大鯢黏液酶解產物對小鼠游泳時間、各項生化指標的影響灌服大鯢黏液酶解產物對小鼠游泳時間及肝糖元、肌乳酸的影響見表 3?？梢钥闯?，灌服大鯢黏液酶解產物的小鼠游泳時間達到 103min，極顯著高于對照組 53.7min( P < 0.01) 。小鼠游泳時間的延長，表明大鯢黏液酶解產物－低聚糖肽能延緩運動性疲勞出現的時間，具有抗運動性疲勞的作用。在小鼠負重游泳力竭后，肝糖原的消耗量比空白對照組減少65.0% ，肌肉中乳酸的量比空白對照組減少了24.4% 。肝糖原與肌乳酸是評價機體疲勞的重要指標。肝糖原貯存越多，抗疲勞能力越強，而乳酸堆積越多，疲勞程度越重。表 3 的大鯢低聚糖肽組和對照組中肝糖原與肌乳酸數值也反映了灌服大鯢黏液酶解產物的小鼠具有抗疲勞能力顯著提高。
葡聚糖 G－200 柱層析兩個洗脫峰的分離組分經凝血活性檢測，第一個峰組分具有血液凝集活性，第二個峰組分也具有血液凝集活性，這說明庫拉索蘆薈凝集素經過分離純化之后，得到了兩種具有凝集活性的蛋白質組分，但至于這兩種組分的具體成分還有待進一步的分析研究。
3 討論
凝集素作為一種非酶和非免疫起源的蛋白質或糖蛋白，廣泛存在于動物、植物和微生物中。在不同的植物中其凝集素的成分是不同的，而且不同種子提取物的凝血活性也會因不同動物血細胞而不同，并且對人類各種血細胞具有獨立特異性。20世 紀 40 年 代，Boyd 和 Renkonen 發 現 利 馬 豆Phaseoluslimensis 和野豌豆 Viciacracca 的粗提物可以凝集 A 型血卻不能凝集 B 型和 O 型血，但是蘆筍豆Lotustetragonolobus 卻能凝集 O 型血。這些豆類凝集素或者是凝集 A 型血細胞，或者是凝集 O 型血細胞，或者是同時凝集 A、B 型血細胞。而蘆薈凝集素是一種蛋白質，是一類能夠非共價地和糖類結合的蛋白質，它具有高度的糖結合專一性，是生物化學和免疫學研究中的一種廣泛應用的工具。蘆薈凝集素能專一性地凝集兔血細胞和人血紅細胞的 A 型和 O 型，不凝集 B 型和 AB 型。所以可以根據蘆薈凝集素特有的凝血性質對其進行鑒定，判斷所提取的物質中是否含有蘆薈凝集素。而且它能附在人體細胞上，激活人體細胞中天然的生長因子，刺激細胞內部反應，促進細胞生長和分裂，加快受傷組織康復和愈合，增強淋巴細胞功能，從而提高人體抵抗各種疾病的能力和抗感染能力。
在本實驗中庫拉索蘆薈經搗碎勻漿、鹽析、透析后得到了蘆薈凝集素的粗提液，經凝血活性檢測粗提液可以凝集兔血，所以證明了在粗提液中具有蘆薈凝集素成分，這也就為下一步實驗的可實施性奠定了基礎。再將粗提液進行過膜濃縮、葡聚糖 G－75凝膠過濾層析后，分離出三種蛋白質峰，經過凝血活性檢測，只有第一個蛋白峰具有凝集活性，且分離純化后的蘆薈凝集素的活性比分離純化前粗提液中的活性進一步提高了。收集具有活性的收集液，經過濃縮，再用葡聚糖 G－200 凝膠過濾層析后得到了蘆薈凝集素的兩種組分，經凝血活性檢測，兩種組分均具有凝血活性，但至于兩種組分的具體化學成分是什么還有待于今后進一步的實驗研究。
