大鯢低聚糖肽性質初步研究

大鯢低聚糖肽 2010 年 11 月由遼寧省水產品加工及綜合利用重點開放實驗室制備; 咔唑、無水乙醇、四硼酸鈉、間羥基聯苯、乙酰丙酮、對－二甲基苯甲醛、無醛乙醇、間苯二酚、硫酸銅、乙酸丁酯－丁醇( 體積比 4∶1) 、鹽酸、濃硫酸等試劑 均為國產分析純。

1.2 實驗方法

1.2.1 大鯢低聚糖肽基本組成測定 準確稱取 0.5g大鯢低聚糖肽，于 100mL 容量瓶中定容，制得大鯢低聚糖肽溶液，備用。

1.2.1.1 蛋白含量測定 采用 Follin－酚法。取大鯢低聚糖肽溶液 20μL，置于干凈的試管內，加 5mLFollin 甲液，置于 25℃ 水浴中 10min 后，加入 0.5mLFollin 試劑乙，繼續水浴 30min，于 500nm 處測量吸光值。

1.2.1.2 糖含量測定 采用苯酚－硫酸法。取 0.1mL大鯢低聚糖肽溶液，加入 1mL 6% 苯酚溶液后，加 5mLH2 SO4，靜置 20min，于 490nm 處測量吸光值。

1.2.1.3 鹽酸氨基葡萄糖含量測定 采用乙酰丙酮法。取大鯢低聚糖肽溶液 0.5mL，置于干燥的具塞比色管中，加水至 5.0mL，然后加 1.0mL 乙酰丙酮溶液，搖 勻，于沸水浴中加熱 25min，取 出，冷 卻。加對－二甲基苯甲醛溶液 1.0mL，搖勻，60℃ 水浴 1h，放置冷卻，于 525nm 處測量吸光值。

1.2.1.4 半乳糖醛酸含量測定 采用硫酸咔唑法。取大鯢低聚糖肽溶液 1.0mL，置于干燥的具塞比色管中，冰水浴中加入四硼酸鈉－ 硫酸溶液 5.0mL，混勻后，沸水浴加熱 20min，取出后立即冷卻至室溫，加0.15% 咔唑溶液 0.2mL，搖勻，在室溫下保持 2h，在530nm 處測量吸光值。

1.2.1.5 葡萄糖醛酸含量 采用間羥聯苯法。取大鯢低聚糖肽溶液 0.5mL，加入試管中，置冰水浴中，加入 4.5mL 四硼酸鈉－硫酸溶液，繼續冷卻，充分振蕩，將試管置于沸水浴中加熱 10min，立即放入冰水浴中冷卻，加入 0.05mL 0.15% 間羥基聯苯溶液，充分振蕩，靜置 20min，在 525nm 處測量吸光值。

1.2.1.6 唾液酸含量測定 采用間苯二酚法。取大鯢低聚糖肽溶液 1.0mL，置于干凈的試管內，加間苯二酚 － 鹽 酸 溶 液 ( 分 別 量 取 2% 間 苯 二 酚 溶 液2.5mL，0.1mol /L 硫酸銅溶液 62.5μL，25% 鹽酸溶液20mL，加水稀釋至 25mL，混勻。實驗前 4h 內配制)1mL，沸水浴 30min，取出置冰浴 3min，加乙酸丁酯－丁醇液( 乙酸丁酯－丁醇的體積比 4∶1) 2mL，充分混勻，室溫放置 10min，在 580nm 處測量吸光值。

1.2.2 大鯢低聚糖肽氨基酸組成分析 將大鯢低聚糖肽干燥至恒重，取一定量樣品在 6mol /L 鹽酸中，在 110℃條件下消化 24h，脫酸后，用水定容至 5mL，在氨基酸自動分析儀上測定樣品中氨基酸的組成。

1.2.3 β－消旋反應測定糖肽鍵連接方式 準確稱取大鯢低聚糖肽樣品 5mg，溶于 3mL 蒸餾水中，然后將樣品 溶 液 分 成 兩 等 份，各 1.5mL。其 中 一 份 加 入1.5mL 蒸餾水; 另一份加入 1.5mL 0.4mol /L NaOH 溶液，反應2h 后，兩份溶液分別在200～400nm 范圍內進行紫外光譜掃描，得到 β－消除反應前后紫外掃描圖。

1.2.4 血細胞凝集法測定糖肽鍵連接方式 采用專一性識別－Galβ1－3 GalNAc α－O－Ser/Thr 結構的凝集素( CAL，海綿凝集素) ，進行三組 B 型血紅細胞凝集實驗。第一組在血紅細胞懸液中加入凝集素; 第二組血紅細胞懸液; 第三組在血紅細胞懸液中加入凝集素和大鯢低聚糖肽。室溫孵育 30min 后顯微鏡下觀察血紅細胞凝集現象。1.2.5 紅外光譜測定 取一定量的大鯢低聚糖肽干粉與 KBr 混合壓片，在 400～4000cm－ 1范圍內進行紅外光譜掃描。

 

2.1 大鯢低聚糖肽基本組成分析

經化學分析方法測定大鯢低聚糖肽的基本組分，結 果 見 表 1。大鯢低聚糖肽中總糖含 量 為15.15% ，總蛋白含量為 80.01% 。其中鹽酸氨基葡萄糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸和唾液酸含量分別3.39% 、0.65% 、2.45% 和 0.60% 。葡萄糖醛酸具有抗腫瘤、抗凝血、增強機體免疫力的作用，是刺參酸性粘多糖的主要成分。唾液酸具有提高人體免疫力、抗癡呆、提高記憶力和智力的作用，是燕窩的主要功能成分。因此，組成大鯢低聚糖肽的糖成分對人體具有保健功能。

大鯢低聚糖肽的氨基酸組成見表 2。由表 2 可知，大鯢低聚糖肽中所含的 18 種氨基酸中除色氨酸未測出外，人體其它 7 種必需氨基酸( 蘇氨酸、纈氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、賴氨酸)和組氨酸( 嬰兒所必需的氨基酸) 的含量均較高。其中必需氨基酸中蘇氨酸含量最為豐富，高達 13.1% 。其次是天冬氨酸/酰胺( Asx) 和谷氨酸/酰胺( Glx) 分別為 11.2% 和 12.5% 。而絲氨酸含量最低為 0.2% 。精氨酸為人體半必需氨基酸，有良好的降血壓作用。苯丙氨酸是人體內腎上腺素、甲狀腺和黑色素合成的原料。組氨酸對嬰幼兒也屬于必需氨基酸，在新生兒及兒童生長發育期起著非常重要的作用。它具有抗潰瘍和促進細胞再生的作用，幼兒缺乏組氨酸將導致貧血。由此可見，大鯢低聚糖肽具有潛在的多種保健功能。

2.2 大鯢低聚糖肽鍵特征分析β－消旋反應是一種鑒定糖肽鍵中是否存在 O－連接糖肽鍵的常用方法，O－連接糖肽鍵在堿作用下很容易斷裂。糖肽鍵在用堿處理時，與 O－糖肽鍵連接的絲氨酸生成 α－氨基丙烯酸，蘇氨酸生成 α－氨基丁烯酸，這種不飽和氨基酸的形成，在 240nm 波長處紫外吸收增強。其 β－消旋反應前后大鯢低聚糖肽的紫外吸收圖譜如圖 1。由圖 1 可見，在 240nm處 β－消旋反應后大鯢低聚糖肽的紫外吸收顯著增強，說明大鯢低聚糖肽中存在 O－連接糖肽鍵。